细胞凋亡检测技术与方法

细胞凋亡（Apoptosis），又称细胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间，但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究，成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。从近年的SCI排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的持续升温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已经有商品化的产品出现，大大加速了研究的进程。具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法：
 
       1． 早期检测:

        1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测:

        PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生, 可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。

        BioVision公司位于美国加州，是世界上首屈一指专着于凋亡和细胞信号研究的公司。其产品质优、价廉、包装使用方便。BioVision提供多种标记的Annexin V产品，并有与核染料PI组成完整早期凋亡检测试剂盒。

        BMS（Bender Medsystems）公司拥有Annexin V专利权，可提供各种规格的Annexin V凋亡检测试剂盒。其中Annexin V FITC试剂盒中包含Annexin V和核染料PI，且具小包装，适合检测小样本的客户。

       另外，Biovision公司和德国美天妮公司提供磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

        2）细胞内氧化还原状态改变的检测：

       正常状态下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

       由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。

       3）细胞色素C的定位检测

       细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

       细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。Cytochrome c Apoptosis Assay Kit试剂盒可以有效地检测凋亡过程中细胞色素c的释放情况。

       4) 线粒体膜电位变化的检测：

       在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。Biovision公司的MitoCaptureTM Mitochondrial Apoptosis Detection Kit（MitoCaptureTM线粒体凋亡检测试剂盒）可以简单、灵敏地体外分析、检测线粒体在凋亡过程中的变化。
 
        2． 晚期检测：
 
      细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。

        1） 凋亡 DNA Ladder 检测试剂盒

       细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。Quick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit可以快速（约1-2小时）、灵敏地检测凋亡细胞中的DNA片段。

       2） TUNEL-based DNA 片段分析试剂盒

       细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测。Apo-BrdUTM分析使用2种颜色的TUNEL方法用流式细胞仪检测凋亡细胞中DNA条带。采用的BrdU比生物素标记的或地高辛（digoxigenylated）标记的方法灵敏度更高。新增的ApoBrdU-IHCTM是一种完整的试剂盒用于双色的免疫组化（IHC）检测DNA片段。Apo-DIRECTTM是非常简单的一步标记凋亡细胞，用于流式细胞术分析。

       3）Caspase分析试剂和试剂盒

        Caspase在细胞凋亡中发挥着重要的作用，属于天冬氨酸蛋白酶。其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。在正常状态下，caspase家族都以无活性的酶原(30～50kD)形式表达，Caspase酶原由原结构域、大亚基（～20kD ）和小亚基(～10kD )构成。当细胞发生凋亡时caspase可以被蛋白酶裂解，大亚基和小亚基形成活化的caspase。一些caspase活化后可以次序激活其他caspase形成caspase级联反应，促发细胞凋亡。