WB实验步骤

1、蛋白样品的制备：通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白

2、做胶：检测抗原10－30kd, 用15％分离胶；30－100kd, 用10％分离胶；100－200kd，用7.5％分离胶。

3、跑胶：压缩胶电压：80V（10mA）；分离胶电压：120V（20mA）当溴酚兰指示剂到达凝胶底部时，即停止电泳。

4、转膜：目的蛋白分子80-140kDa时，胶浓度8%，转移时间为1.5-2小时；目的蛋白分子25-80kDa时，胶浓度10%，转移时间为1.5小时；目的蛋白分子15-40kDa时，胶浓度12%，转移时间为0.75小时；目的蛋白分子＜20kDa时，胶浓度15%，转移时间为0.5小时；

5、封闭：脱脂奶粉（5％）、BSA、Western Blot 膜封闭液

6、一抗杂交：5％奶粉或2％BSA稀释抗体（称一抗），稀释比例按抗体说明,室温孵育1hr，TBST 洗5 mins 3-5 次。

7、二抗杂交：将膜跟5％奶粉或2％BSA稀释的2 抗一起孵育，室温1hr。TBST 洗5 mins 3-5 次。

8、底物显色：